Частные примеры применения многофакторного поиска

Рассмотрим конкретный пример. Объектом исследований служил штамм Е.соli ВГНКИ 397А/37-14 , продуцент диагностически значимого в ветеринарной микробиологии протективного поверхностного антигена F41. Подобные штаммы вызывают холероподобные диарреи у новорожденных телят и вспышки инфекции в крупных хозяйствах с высоким количеством летальных исходов, принося значительные убытки. Первоначально располагали сывороткой анти-F41, полученной к указанному референс - штамму, которая давала реакцию агглютинации бактериальных клеток при их культивировании на среде Минка /5/ с оценкой (+), на пределе чувствительности. Это медленное (5 - 6 мин) неполное образование мелких зерен из суспензии бактериальных клеток, видимые при небольшом увеличении, и отсутствие агглютинации при культивировании на агаре Хоттингера или кровяном и шоколадном агаре. Максимально возможная оценка агглютинации - (4+) - быстрое (1-2 сек) слипание всех клеток в крупные, видимые невооруженным глазом, быстро восстанавливающиеся после перемешивания конгломераты. Морфологически названный антиген - фимбрии на поверхности клеток - при просмотре в электронном микроскопе не выявляли. Возникло предположение, что ген, ответственный за синтез антигена F41, подвержен регуляции компонентами питательной среды.

Для проведения поиска факторов, влияющих на синтез целевого продукта, был выбран план ОЭ, представленный в таб. 4 и факторы, указанные выше в качестве примера в общей части, по сверхнасыщенной схеме 2-го типа (два фактора в одном столбце, по одному фактору на уровень).

В результате серии экспериментов, поставленных по вышеприведенной схеме, было найдено, что регуляторными факторами для синтеза антигена F41 клетками E coli ВГНКИ 397А/37-14 являются величина рН, концентрации глюкозы и неорганического фосфата. Такую информацию было практически невозможно найти в сериях однофакторных экспериментов, потому что только в экспериментах первой серии по плану таб.5 в №№1-4 ВП отличался от 0. Поскольку ВП - синтез значимого антигена - определяли полуколичественно, в капельной реакции агглютинации со специфической антисывороткой на пределе чувствительности, то в силу низкой точности измерения применять полиномиальную модель было нецелесообразно, что подробно рассмотрено выше.

Кроме этого, наличие практически одинакового ВП в первых 4х экспериментах и ВП = 0 в других (ступенчатое распределение зависимости ВП от № эксперимента, кусочно-непрерывная связь ВП = F(№э)), делает невозможным применение результатов для расчета коэффициентов полиномиальной модели. Построение корреляционной таблицы и применение сериального критерия позволяет наглядно выделить группу сильнодействующих факторов, установить связь между явлениями, оценить надежность сделанных выводов и обоснованно спланировать следующую серию экспериментов. После проведения дополнительных серий многофакторных и однофакторных экспериментов с меньшим количеством подозреваемых факторов была сконструирована плотная питательная среда на основе кислотного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта с таким соотношением фосфата и глюкозы при рН 8.0. Разработанная среда позволила значительно увеличить синтез диагностически значимого антигена F41 клетками Е.соli ВГНКИ 397A/37-14 при небольшом снижении урожая биомассы, выращенного на чашке. Глубинное культивирование на основе найденной комбинации условий было неудачным для синтеза указанного антигена.

В качестве примера приводим следующие цифры - при иммунизации 8 кроликов живой культурой, выращенной на среде Минка только от одного животного была получена антисыворотка, которая давала реакцию агглютинации с оценкой (+) без разведения антисыворотки. Иммунизация убитой культурой, выращенной на разработанной среде, позволила получить от худшего животного антисыворотку, дающую агглютинацию с оценкой (3+) в разведении 1/10, от лучшего в разведении 1/30, всего было использовано 7 кроликов. Оценка (3+) - слипание бактериальных клеток в течение 1 мин. в устойчивые к перемешиванию конгломераты различной величины. Допускается наличие небольшого количество не слипшихся клеток.