Аннотация
В предлагаемой работе рассмотрена задача прикладной микробиологии по
поиску компонентов питательной среды и условий культивирования, влияющих на
синтез экономически значимого продукта (ферменты, антигены, антибиотики).
Представлен разработанный двухуровневый план отсеивающего эксперимента с
15ю проверяемыми факторами на 16ти экспериментальных
точках, близкий к оптимальному по равномерному учету сочетаний пар факторов в
серии экспериментов. План единственный и оптимальный для случая отсутствия
априорной информации и указанных количеств факторов, позволяет проверить до 30
факторов при размещении нового фактора на каждом уровне.
Предлагается алгоритм построения двухуровневых планов второго шага,
уточняющих найденные факторы, увязанные с полученной информацией. Построен
близкий к оптимальному трехуровневый план переходного к оптимизации
эксперимента, позволяющий уточнить уровни и факторы при проверке 5 факторов на
8 экспериментальных точках. Предлагается новая форма записи, уменьшающая
вероятность ошибки при экспериментальной постановке.
Рассмотрены ограничения двухуровневого полного факторного эксперимента
при решении задач нахождения оптимальных условий культивирования как
некорректно поставленной задачи и предложен путь регуляризации через оценки
значимости коэффициентов полинома с применением непараметрических критериев,
построения графиков, корреляционных таблиц и корреляционных полей до решения
системы линейных уравнений.
Предисловие
Развитие биотехнологии, совершенствование рационов вскармливания
сельскохозяйственных животных и растений, расширение производства пищевых
добавок для людей ставят задачу быстрого поиска компонентов питания с
повышенной биологической активностью. В опубликованной литературе задачи
оптимизации рационов разработаны достаточно глубоко, но задачи оптимального
поиска компонентов питания с повышенной биологической активностью разработаны
слабее и на наш взгляд не отвечают современным потребностям промышленности и
сельского хозяйства.
В предлагаемой работе рассмотрены в первую очередь задачи поиска,
близкого к оптимальному, физиологически активных компонентов пищи (нутриентов),
необходимых разнообразным живым системам для интенсивного роста и синтеза
биологически активных соединений (экономически важного целевого продукта).
Наиболее полно в существующей литературе эти вопросы рассмотрены для
микроорганизмов в классическом руководстве Максимова, Федорова /1/, но эта
монография уже давно стала библиографической редкостью. К тому же методы
обработки результатов активного поиска (отсеивающего эксперимента) рассмотрены
недостаточно полно, не отражено применение компьютеров при обработке
результатов, слабо рассмотрены ограничения ДУПФ, сильный акцент на ручные
вычислительные операции и от читателя требуется достаточно высокая
математическая подготовка, что ограничивает контингент потенциальных
пользователей.
В предлагаемой работе предпринята попытка ликвидировать или сократить
перечисленные пробелы. Первоначально рассмотрены задачи планирования и
обработки результатов активных экспериментов при проведении поиска, близкого к
оптимальному. Предложены критерии оптимальности построения серии поисковых
экспериментов на основе насыщенных и сверхнасыщенных планов отсеивающего
эксперимента. Эта часть работы не требует повышенной математической подготовки,
но подразумевает достаточно развитую интуицию исследователя. По нашему мнению,
без интуиции поисковые работы проводить не рационально, поскольку
первоначальный выбор подозреваемых переменных и их уровней (интенсивностей) не
формализуем, и лежит вне математики.
Далее рассмотрены ограничения двухуровневых полного и дробного факторных
экспериментов для нахождения области, близкой к оптимальной. Эта часть
предполагает наличие повышенной математической подготовки и более углубленного
рассмотрения материала при наличии хорошего пространственного воображения, но
без участия интуиции.
На основании собственных и опубликованных в доступной литературе
результатов, рассмотрено применение отсеивающего эксперимента (ОЭ) и
двухуровневого полного факторного эксперимента (ДПФЭ) при изучении влияния
условий культивирования бактерий на синтез белков (ферменты антигены),
представляющих экономический интерес. Экспериментальная часть работы была
сделана на базах ИБФМ РАН (Пущино) и бывшего ВНИИ прикладной микробиологии,
ныне Гос НИИ ПМ, бывшей фирмы “Диавак ”(Оболенск, Моск. Обл.).
Поскольку личный опыт автора основан на работе с бактериями, а так же то,
что микроорганизмы являются наиболее простыми из самостоятельно живущих
организмов и, возможно, наиболее значимыми элементами в процессах
биотехнологии, то основные примеры приведены из области микробиологии. По
нашему мнению, предлагаемые математические и методологические подходы могут
быть легко обобщены и для более сложных продуцентов, поскольку регуляция
активности оперона условиями внешней среды одинакова для всех известных
организмов / 15/.
Методологическое обоснование
Из всех биологических наук микробиология - наиболее точная и наиболее
математизированная. Ряд задач микробиологии невозможно решить без
математической обработки результатов измерений, по крайней мере, некоторых
свойств и параметров микробиологической популяции и без применения хотя бы
простейших математических моделей. Важность такого подхода подтверждается тем,
что микроорганизмы являются продуцентами многих уникальных физиологически
активных соединений, к которым можно отнести ферменты, антигены, антибиотики
как наиболее значимые.
Современные технологические процессы невозможно вести без применения
математики. Рост фармацевтической промышленности и биотехнологии в последнее
время вызывает увеличение спроса на промышленно важные микроорганизмы.
Многие микроорганизмы способны синтезировать ряд ЦП, которые не
синтезируют другие организмы. Но нередко перспективный штамм производит синтез
экономически важного целевого продукта при выращивании на плотной питательной
среде и не способен синтезировать его при глубинном культивировании. Возможен
вариант, когда глубинное культивирование на питательных средах с использованием
гидролизатов и вытяжек из сырья природного происхождения не обеспечивает
стабильного получения ЦП и выход ЦП сильно зависит от партии питательной среды.
Это ухудшает технологические показатели продуцента и может служить основанием
для отказа от такого микроба при использовании в промышленных масштабах. В
таком случае можно говорить о наличии метаболизируемых ингибиторов или
индукторов нужного синтеза. Молекулярное клонирование и прочие генно-инженерные
операции не решают проблемы, поскольку в изученный продуцент переносят
рекомбинантную ДНК вместе с регуляторными участками. Необходимо проводить комплексное
изучение продуцента.
Встает вопрос о возможности нахождения регуляторных факторов и переходе к
управляемому культивированию. Названную операцию можно осуществить, если
производить целенаправленный активный поиск регуляторных факторов.
Процесс поиска осложняется тем, что в качестве регуляторного фактора
могут выступать несколько индивидуальных химических соединений разных классов
(минеральные компоненты, углеводы, источники азота и т. д.), либо иных условий
культивирования (рН, аэрация) действующих одновременно и взаимовлияюще [1]
На наш взгляд, проще производить поисковую работу, если проводить поиск
на синтетических средах и средах контролируемого химического состава, что
достаточно доступно на современном уровне. Поскольку теоретически возможное сочетание
различных комбинаций факторов весьма велико, то необходимо вести некий
оптимальный поиск. Так как каждый микроб достаточно ограничен в своих
потенциальных возможностях, то задача имеет решение. Подобные работы уже
проводили неоднократно и в литературе описаны ряд планов поиска, близких к
оптимальному. Критерии оптимальности в большинстве случаев не сформулированы.
Отсутствуют опубликованные правила построения и условия применения планов
поиска, работу во многом производили на интуитивном уровне, не указаны ряд, на
наш взгляд, существенных моментов поиска.
Применение микроорганизмов в технологическом процессе предъявляет ряд
требований к свойствам промышленного штамма - глубинное культивирование,
рентабельный выход ЦП, безопасность для окружающей среды, наличие нескольких
селективных маркеров, желателен выход ЦП в культуральую среду, низкий уровень
спонтанного мутагенеза и т.д..
Знание общих закономерностей питания микроорганизмов мало что дает при
работе с конкретным продуцентом. Необходима стратегия поиска лимитирующих,
ингибирующих и индуцирующих нужный синтез факторов (регуляторных факторов)
среди множества возможных кандидатов из многочисленных потенциально
осуществимых условий культивирования.
Выяснение количества и роли регуляторных факторов позволяет решить вопрос
о целесообразности применения мутагенеза и перехода от дикого штамма к более
технологичному мутанту.
Задача поиска регуляторных факторов осложняется наличием значительного
межфакторного взаимодействия (сильная кривизна поверхности отклика -
зависимости ВП от условий культивирования). При таких начальных условиях серия
однофакторных экспериментов дает мало информации, а в ряде случаев, при наличии
нескольких регуляторных факторов, в принципе не позволяет решить задачу поиска.
Необходимо проводить многофакторный поиск, используя индивидуальные химические
соединения в серии многофакторных экспериментов по планам, близким к
оптимальным для поиска.
Последовательность применения математики в микробиологической работе -
количественное измерение одного или нескольких свойств, построение таблиц,
построение графиков, разработка регрессионных зависимостей, построение
математических моделей. Для проведения поиска регуляторных факторов, близкого к
оптимальному, нередко достаточно даже качественных измерений с неизвестной
ошибкой, построения на этих основаниях таблиц и графиков, что не требует ни
большого количества арифметических вычислений, ни повышенной математической
подготовки.
Вступление
Успехи, достигнутые при изучении и оптимизации процессов, зависящих от
большого количеств факторов, стали возможными благодаря широкому внедрению
математических методов планирования эксперимента. Возникает необходимость
изменения методологии биологических исследований. Принцип поочередного
изменения в эксперименте каждого фактора на фоне постоянного уровня остальных
(метод Зайделя-Гаусса /1/) не является универсальным и окончательным, а всего
лишь часть комплексного исследования объекта, нередко применимого только на
ранних стадиях исследования. Биологические системы, зависящие от большого
количества факторов с сильным межфакторным взаимодействием при современных
требованиях практики сложно изучать, моделировать и управлять процессами на
основе мало связанных однофакторных зависимостей. Методология проведения и трактовки
однофакторных зависимостей хорошо разработана и в дополнительных объяснениях,
на наш взгляд, не нуждается /1/.
Представление полученных нередко весьма разнородных результатов измерений
в виде графиков, таблиц, корреляционных полей, нахождение аналогий с более
изученными родственными объектами служат основой к проведению активных
поисковых работ и дальнейшей оптимизации процесса с количественным учетом
влияния нескольких факторов на синтез ЦП.
Состояние популяции микробов существенно зависит от разнообразных по
своему характеру (качественно различных) и по интенсивности (количественно
различных) факторов. Поэтому пред современным микробиологом стоит задача -
комплексное исследование объекта, установление причинно-следственных связей
между различными явлениями, выделение управляемых факторов и воздействие на
них.
Активные поисковые работы с учетом ожидаемой зависимости изучаемого
параметра от нескольких факторов лучше начинать с отсеивающего эксперимента.
Общая часть
TimeBiology