Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.
В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна
KS = ([S] 0 - [ES] - [P]) [E]T - [ES])/[ES]
([S]0 - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой
v= Vmax [St] / (Km + [St])
где [St] - концентрация субстрата в момент времени.
Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S]о = [St]:
) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;
) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.
Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S]0, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:
KS = ([S]0 - [P]) ([E]T - [ES]) / [ES]
Для значения концентрации [St], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]0 + [St])/2. Так как [St] = [S]0 - [Р], среднюю скорость
; можно выразить как
Подставив это выражение и приблизительное значение [St] в
v= Vmax [St] / (Km + [St]),
получим:
При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении Km составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.
Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]0 нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:
Ks = ([S]0 - [ES]) ([E]T - [ES]) / [ES]
Его решение относительно [ES] дает
Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S]0 = 0 или [Е]T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/Vmax мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k2 [ES] и Vmax = k2 [E]T, можно привести к следующему виду:
TimeBiology